1.母种制作
鸡腿蘑菌种主要采用组织分离法得到纯菌种。鸡腿蘑菌丝在PDA培养基(马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，加水至1000毫升)上生长良好。在以下加富培养基或麦粒煎汁培养基上菌丝生长得更好。
(1)马铃薯200克、葡萄糖20克、硫酸镁1.5克、磷酸二氢钾1.5克、磷酸氢二钾1.5克、维生素B1 10毫克、琼脂20克，加水至1000毫升。
(2)小麦200克，浸泡10小时，煮30分钟，滤汁，加葡萄糖20克、蛋白胨3克、硫酸镁0.5克、磷酸二氢钾1.0克、维生素B2 10.2克、琼脂20克，加水至1000毫升。
(3)小麦250克，浸泡10小时，煮30分钟，滤汁，加马铃薯150克、葡萄糖20克、蛋白胨2克、硫酸镁1.5克、磷酸二氢钾1.5克、磷酸氢二钾1.5克、维生素B1 10毫克、琼脂20克，加水至1000毫升。菌丝最初白色，然后变成灰白色，培养基的颜色也随之加深。在恒温箱中，25℃条件下菌丝在7～10天可长满斜面，最快的5～6天。
2.原种制作
采用稻草、棉籽壳、杂木屑三种原料为主制作培养基和用麦粒制作培养基。试验证明，鸡腿蘑的菌丝在这几种培养基上都可以正常生长，但在以麦粒和棉籽壳为主的培养基上生长最好。各种原种培养基的配方如下：
(1)稻草培养基：稻草(切段或粉碎)60%、麸皮25%、玉米粉8%、复合肥5%、糖1%、石灰1%；稻草(切段或粉碎)81.5%，麦麸4.5%，玉米粉8%，复合肥5%，石灰1%。
(2)棉籽壳培养基A：棉籽壳90%、麸皮4.5%、玉米粉4.5%、石灰1%。
(3)棉籽壳培养基B：棉籽壳87.5%、麸皮10%、尿素0.5%、石灰2%。
(4)棉籽壳培养基C：棉籽壳78%、麸皮10%、玉米粉5%、复合肥5%、糖1%、石膏1%、维生素B1微量。
(5)木屑培养基杂：木屑75%、麸皮15%、玉米粉8%、糖1%、石膏粉1%、维生素B1 微量。
(6)麦粒培养基：麦粒加水，浸泡10～15小时，加1%石灰粉煮沸30分钟(至无白心，而皮不破)，稍晾后装瓶。
以上培养基的含水量均控制在60%～65%，所有培养基均保持自然pH值，按常规方法装瓶，塞棉塞，常压或高压蒸汽灭菌。冷却后，在无菌箱或无菌室中无菌操作接入母种，置于24～26℃的温室或温箱中培养。经30～35天鸡腿蘑菌丝就可以长满全瓶。除固体菌种外，鸡腿蘑的原种也可以用液体培养基进行培养，制成液体原种。在各母种培养基配方中取消琼脂，即可作为液体培养基配方。
鸡腿蘑菌种的好坏对子实体的产量影响甚大，应加以注意。菌株不同，菌丝的形态也不完全一样。有的菌株起初是线状的，后来逐渐产生气生菌丝；有的菌株起初是棉絮状，后来逐渐变成线状，色泽为白色或灰白色。好的菌种利用培养料的能力强，菌丝生长较快。
